鯊魚肉乙醇萃取物的血管新生抑制作用

Lan Yuan, Mayumi Yoshida and Paul F. Davis
Bioactivity Investigation Group, Wellington School of Medicine and Health Sciences, Wellington, New Zealand

目次

前言

早在1990年前後、鯊魚軟骨粉因為其血管新生抑制作用、作為一種可能的治療製劑、被廣泛推廣用來治療實體瘤。 然而直到1997年、才有確鑿的證據證明口服鯊魚軟骨粉具有抑制血管新生效果1。 初步的研究顯示、從鯊魚各器官中萃取的富含脂質的製劑也被發現有血管新生抑制作用(未發表的資料)。 於是、我們就開始研究鯊魚脂質對于血管新生誘導因子的影響。 由於鯊魚肉乙醇萃取物(學名﹕Macolipin)的濃度太高、所以有必要加入其他的菜油或烹飪油進行稀釋。 但是、大多數油類添加後效果不理想、只有橄欖油與鯊魚肉乙醇萃取物混合後才發現有相乘效果。

本研究提供的是我們的初步研究來說明鯊魚肉油和橄攬油混合物的血管新生抑制作用機理。 我們將該混合物與有促血管新生作用的細胞因子(如FGF–2和VEGF)、生長因子和它們的受體相混合、然後觀察對它們的影響。

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材料與方法

材料

除了專門注明的材料外、本實驗中用到的所有化學物質均採購於Sigma Chemical Co. （St.Louis, Mo）。 實驗中用到血管新生誘導因子是重組人的血管內皮細胞生長因子121（rHu VEGF-121）、FGF-2、PDGF-AB和TGF–β。 可溶性受體是重組人VEGF-R1(FLT-1)和VEGF-R2(FLk-1, KDR)。 本實驗中用到的主要抗體是VEGF羊抗人單克隆抗體[immunoglobulin （Ig）G fraction]、抗人VEGF-R1抗體和抗人VEGF-R2抗體、後兩種抗體均為鼠源單克隆抗體。 次要抗體是兔抗羊IgG（peroxidase conjugated）和兔抗鼠IgG（peroxidase conjugated）。

聚丙烯酰胺凝膠電泳中用到的試劑和設備均採購於BioRad Laboratories（Hercules, CA）。 Immobilon膜購於Millipore Corp. （Bedford, MA）。 色原試劑3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(簡稱TMB)採購於Sigma Chemical Co.。

本實驗中用到的鯊魚肉油和橄攬油混合物由Aotea Pacific Ltd(新西蘭奧克蘭)提供、混和物中鯊魚肉油和橄攬油的比例是1﹕9。

方法

體外血管新生實驗（主動脈環實驗）。 這種實驗分析在Nicosia, Ottinetti和Brown等人3的著作中有詳細描述。 從大鼠體內移值出一長段主動脈、然後清除粘附的脂肪和結締組織、接著將其切成數段厚約3毫米的環。 將纖維蛋白原鋪在24孔培養板的孔底部、通過凝血酶作用使其成為凝膠狀。 將主動脈環鋪在每個凝膠的頂部、然後再在上面放上一層纖維蛋白。纖維蛋白原被放在MCDB131培養基中製備。 將雙層纖維蛋白覆在含有待測物質的MCDB131培養基上。

在37℃大氣環境為3%CO2/97%air的情況下、膠原形成三維立體結構的凝膠(在體外模仿了體內新生血管成長的新環境)。 用上射光顯微鏡觀察這些主動脈環和其周邊毛細血管的生長情況。 經過7天的培養後、對其拍攝數碼照片並用NIH圖像軟體分析毛細血管相對於主動脈環的生長程度。

每種測試物質被留樣三份進行測試分析、然後計算平均生長率。 因為所有富含脂質的材料都會被乙醇溶解(最終濃度是0.2%)、所以在所有的分析中用0.2%的乙醇作為對照組。 對照組內的血管新生率為100%、所有樣品的血管新生率與對照組的100%相比較、樣品中血管新生率超過100%的被定義為促進血管新生、樣品中血管新生率低於100%的被定義為抑制血管新生。

免疫複合物的製備表1顯示的是反應樣本的製備情況、在室溫情況下振動兩小時後開始反應（第五和九號樣品是在反應後1小時加入VEGF的）。

表1 VEGF與其受體的免疫複合物的調整(含/不含鯊魚肉油和橄攬油)
  VEGF
(5μg/mL)
(μL)		 VEGF-R1
(10μg/mL)
(μL)		 VEGF-R2
(10μg/mL)
(μL)		 鯊魚肉油和橄欖油
(100μg/mL)
(μL)		 橄欖油
(100μg/mL)
(μL)		 結合緩衝液
(μL)		 水
(μL)
1 20       20 50 110
2   100     20 50 30
3 20 100     20 50 10
4 20 100   20   50 10
5 20 b 100   20   50 10
6     100   20 50 30
7 20   100   20 50 10
8 20   100 20   50 10
9 20 b   100 20   50 10
a　含有4mM CaCl2、0.4mMCuSO4M和0.5%Tryptone的Dulbecco's MEM培養基。
b　1小時後加入
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結果

材料

為了驗證這種鯊魚肉油和橄攬油混合物的血管新生抑制作用、我們採用的是主動脈環實驗、並用橄欖油作對照組。 如表2所示、實驗結果顯示這種混合物（不只是橄欖油）以劑量依存的形式抑制主動脈環血管新生。
表2 鯊魚肉油對血管新生的作用
 對照組抑制%
橄欖油(30.0μg/mL)100.0%0.0%
鯊魚肉油和橄欖油(10μg/mL)81.03%18.97%
鯊魚肉油和橄欖油(30μg/mL)44.06%55.94%

我們的主動脈環實驗驗證了這種鯊魚肉油和橄攬油混合物對於血管新生誘導因子的作用、這些因子包括VEGF、PDGF、TGF–β和FGF–2。

VEGF

VEGF是最強效的血管新生誘導因子之一4-7、所以我們也進行了數個實驗來驗證鯊魚肉油和橄攬油混合物對於VEGF的影響。 表3就是這些實驗結果的總結。
表3 鯊魚肉油對於VEGF的血管新生誘導作用的效果
 對照組抑制%
VEGF(32.6ng/mL)134.14%34.14%促進
鯊魚肉油和橄欖油(30μg/mL)45.18%54.82%抑制
VEGF(32.6ng/mL)＋鯊魚肉油和橄欖油(30μg/mL)46.00%54.00%抑制

VEGF可以誘導血管新生、而鯊魚肉油和橄攬油混合物如我們預計的那樣抑制了血管新生。 當它們被混合在一起時、鯊魚肉油和橄攬油混合物抑制了VEGF誘導的34%血管新生。 這種抑制情況與單獨使用鯊魚肉油和橄攬油混合物（相同濃度）時的抑制情況完全一樣。 這表明鯊魚肉油和橄攬油混合物強效干擾了VEGF和其在血管新生過程中的作用。

FGF-2

FGF–2也是一種血管新生誘導因子8-10。 儘管它沒有VEGF那樣強效、但是在血管新生活躍的組織中經常會積聚較高濃度的FGF–2、所以它的作用也不可忽視。 我們研究了鯊魚肉油和橄攬油混合物對於FGF–2誘導的血管新生的作用(表4)。
表4 鲨鱼肉油对于FGF-2的血管新生诱导作用的效果
 對照組抑制%
FGF-2 (10ng/mL)141.22%41.22%促進
鯊魚肉油和橄欖油(10μg/mL)89.46%10.54%抑制
FGF-2 (10ng/mL)＋鯊魚肉油和橄欖油(10μg/mL)84.18%15.82%抑制

如預期的那樣、FGF–2誘導了血管新生、而鯊魚肉油和橄攬油混合物抑制了FGF–2誘導的血管新生。 當它們被混合在一起時、總體上鯊魚肉油和橄攬油混合物抑制了FGF–2誘導的血管新生。 這種抑制情況與單獨使用鯊魚肉油和橄攬油混合物時的抑制情況完全一樣。 這表明鯊魚肉油和橄攬油混合物干擾並完全抑制了FGF–2的作用。 這個過程與剛才提到的鯊魚肉油和橄攬油混合物強效干擾VEGF是類似的。

PDGF

PDGF也是一種經常被提及的活躍的血管新生誘導因子11,12。 它有幾種同源異構體(isoform)13-17、本實驗中用到的是三種同源異構體(PDGF-AA, PDGF-BB和PDGF-AB)的混合物。 表5就是這些實驗結果的總結。
表5 鲨鱼肉油对于PDGF的血管新生诱导作用的效果
 對照組抑制%
PDGF (6ng/mL)130.23%30.23%促進
鯊魚肉油和橄欖油(30μg/mL)64.25%35.75%抑制
PDGF (6ng/mL)＋鯊魚肉油和橄欖油(30μg/mL)115.99%15.99%促進

在濃度相對較低的情況下(6 ng/ml)、PDGF誘導了30%的血管新生。 所以在這個特殊的分析裏、需要使用較高濃度的鯊魚肉油和橄攬油混合物才能產生較可觀的抑制效果。 然而、鯊魚肉油和橄攬油混合物只是體現出輕微的抑制效果。 從另外一個角度來看、PDGF很大地克服了鯊魚肉油和橄攬油混合物的抑制效果。 所以、我們認為鯊魚肉油和橄攬油混合物不能很大地干擾PDGF的活動。

TGF-β

TGF–β是一種誘導血管新生的轉化生長因子18-20。 表6顯示的是TGF–β及鯊魚肉油和橄攬油混合物的作用。
表6 鯊魚肉油對於TGF-β的血管新生誘導作用的效果
 對照組抑制%
TGF-β(0.08ng/mL)121.09%21.09%促進
鯊魚肉油和橄欖油(10μg/mL)75.69%24.31%抑制
TGF-β(0.08ng/mL)＋鯊魚肉油和橄欖油(10μg/mL)81.27%18.73%抑制

TGF–β能夠在較低的濃度下誘導中等上升程度的血管新生率、而鯊魚肉油和橄攬油混合物可以發揮預期的抑制作用。 當這兩種物質被混合在一起時、會產生一種淨血管新生抑制作用、這種抑制作用要略小於單獨使用鯊魚肉油和橄攬油混合物時的抑制作用。

換句話說、鯊魚肉油和橄攬油混合物能夠部分較大得阻斷TGF–β誘導的血管新生活動。 從某種程度來看、這個結果與我們在VEGF和FGF–2研究中觀察到的結果類似。 我們共用了三個實驗來確認了TGF–β的研究。

鯊魚肉油和橄攬油混合物抑制VEGF的進一步研究

由於VEGF被認為是一種重要的血管新生誘導因子、所以它作為一種模型被用來研究鯊魚肉油和橄攬油混合物是如何影響血管新生誘導因子。

鯊魚肉油和橄攬油混合物可能通過與VEGF受體的結合來阻斷或抑制VEGF與其受體的結合。

培養VEGF、VEGF受體及鯊魚肉油和橄攬油混合物

當兩種VEGF的可溶性受體與鯊魚肉油和橄攬油混合物及VEGF共同培養時、VEGF與其受體的結合而形成的複合物被抑制。 這種情況在兩種受體上均有發生(圖. 1)。 為了驗證這種結合是如何被抑制的、我們特地使用了VEGF與其受體的抗體。 當VEGF與VEGF-R1共同培養時、顯示VEGF-R1陽性的高分子量顏色帶顯色出來、這是VEGF與VEGF-R1的結合而形成的複合物(如圖1a, 泳道2中的箭頭所示)。 當鯊魚肉油和橄攬油混合物被加入到培養混合物中時(圖.1a, 泳道3)、顏色帶的顯色較淡、這表示鯊魚肉油和橄攬油混合物有可能抑制VEGF與其受體的結合。 當我們使用VEGF抗體時、我們也發現了顏色帶上相似的顯色情況、這樣就證明了實驗結果（圖2a泳道3,與圖2a,泳道2的高分子量顏色帶相比）。 這說明鯊魚肉油和橄攬油混合物通過與VEGF-R1結合、從而抑制VEGF與其受體的結合。

與不含鯊魚肉油和橄攬油混合物的培養混合物相比、含有鯊魚肉油和橄攬油混合物的培養混合物中也觀察到低分子量VEGF-R1顏色帶的顯色變淡（圖1a泳道3,與圖1a泳道2的低分子量顏色帶相比）。

當用VEGF-R2代替VEGF–R1進行同樣實驗時、我們也觀察到相似的結果。 很明顯、鯊魚肉油和橄攬油混合物可以通過與VEGF–R2結合、從而抑制VEGF與其受體VEGF–R2的結合（圖1b泳道3與圖1b泳道2的高分子量顏色帶相比,如箭頭所示、）。

基於這些顏色帶的變化、當用VEGF–R1和VEGF–R2的抗體作為檢出劑時、這些結果說明鯊魚肉油和橄攬油混合物可以通過與VEGF的這兩種受體相結合、抑制VEGF與受體的結合。 用VEGF抗體（圖2a,b 泳道3）給同樣的凝膠顯色時也可以發現相同情況、當然高分子量顏色帶的變化沒有那麼明顯。

用鯊魚肉油和橄攬油混合物對VEGF受體的前置培養在加入VEGF前、用任何一種VEGF受體與鯊魚肉油和橄攬油混合物前置培養、鯊魚肉油和橄攬油混合物同樣可以抑制VEGF與其受體的結合(圖1)。

當VEGF、受體與鯊魚肉油和橄攬油混合物混合在一起時、也可以發現類似的結果。 當VEGF和VEGF–R1共同培養顯色VEGF–R1(泳道4,與圖1a泳道2相比)時(有鯊魚肉油和橄攬油混合物的情況下)、高分子量顏色帶的顯色較淺。 在第3和4泳道、顏色帶的深度與此相同、這說明用鯊魚肉油和橄攬油混合物進行前置培養與VEGF和VEGF–R1共同培養沒有不同。 這些顏色帶的式樣和深度與用VEGF抗體作為主要顯色抗體時的情況非常類似(圖2a、泳道2–4)。

然而、當我們用鯊魚肉油和橄攬油混合物與VEGF–R2受體進行培養時、高分子VEGF–VEGF–R複合體顯色非常淡。 也就是說、當VEGF–R2受體與鯊魚肉油和橄攬油混合物進行前置培養時(圖1b泳道4,與圖1b泳道2相比)、VEGF–VEGF–R2複合體顯色較淡。 這說明、在前置培養期、與R1受體相比、鯊魚肉油和橄攬油混合物更易與R2受體結合、它與R2受體更有親和性。 我們用VEGF抗體作檢出劑時(圖2b泳道4, 與圖2b泳道2相比))、同等的高分子量複合體也顯色出來、這更支持了我們的分析。

圖.1. VEGF受體和VEGF的免疫印跡
VEGF-R1(a, 泳道1-4)和VEGF-R2(b, 泳道1-4)的培養。 anti-VEGF-R1(a, 泳道1-4)和anti-VEGF-R2(b, lanes1-4)的免疫印跡。
泳道M: 分子量標記(左側的墨蹟顯示的是實際分子量)
以下的培養液被加入到凝膠中。
a
泳道1: VEGF-R1
泳道2: VEGF-R1＋橄欖油＋VEGF
泳道3: VEGF-R1＋鯊魚肉油和橄欖油＋VEGF
泳道4: 加入VEGF前用鯊魚肉油和橄欖油中預處理的VEGF-R1
b
泳道1: VEGF-R2
泳道2: VEGF-R2＋橄欖油＋VEGF
泳道3: VEGF-R2＋鯊魚肉油和橄欖油＋VEGF
泳道4: 加入VEGF前用鯊魚肉油和橄欖油中預處理的VEGF-R2

圖.2. VEGF受體和VEGF的免疫印跡
VEGF-R1(a, 泳道1-4)和VEGF-R2(b, 泳道1-4)的培養。 anti-VEGF-R1(a, 泳道1-4)和anti-VEGF-R2(b, 泳道1-4)的免疫印跡。
泳道 M: 分子量標記(左側的墨蹟顯示的是實際分子量)
以下的培養液被加入到凝膠中。
a
泳道1: VEGF-R1
泳道2: VEGF-R1＋橄欖油＋VEGF
泳道3: VEGF-R1＋鯊魚肉油和橄欖油＋VEGF
泳道4: 加入VEGF前用鯊魚肉油和橄欖油中預處理的VEGF-R1
b
泳道1: VEGF-R2
泳道2: VEGF-R2＋橄欖油＋VEGF
泳道3: VEGF-R2＋鯊魚肉油和橄欖油＋VEGF
泳道4: 加入VEGF前用鯊魚肉油和橄欖油中預處理的VEGF-R2
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討論

血管新生是一個涉及到多個步驟的過程21,22、血管新生誘導因子可以在任何一個步驟中起作用。 比如說、內皮細胞的增殖、基質金屬蛋白酶活性、在細胞因子和誘導因子增殖階段起阻礙劑作用和開發性血管。 另外、鯊魚肉油和橄攬油混合物是一種多成份的製備物、不同的成份可能在血管新生的不同階段發揮作用。

為了研究細胞和分子方面的鯊魚肉油和橄攬油混合物作用、我們設計了多個實驗來驗證它是否會影響血管新生的正面調整活動。 許多複合物會誘導血管新生。 在本實驗中、我們發現鯊魚肉油和橄攬油混合物能完全抑制VEGF、FGF–2和TGF–β的作用。 換句話說、如果將鯊魚肉油和橄攬油混合物與以上任何一種因子相混合、血管新生作用會完全喪失、這與單獨使用鯊魚肉油和橄攬油混合物時體現的作用完全一樣。 對於其他的誘導因子(PDGF)來說、它顯示出部分的血管新生抑制作用。 所以、鯊魚肉油和橄攬油混合物能有效抑制所知的血管新生誘導因子。 這個多效性說明鯊魚肉油和橄攬油混合物能干擾血管新生的多個步驟、所以它是一種強效的血管新生抑制產品。

VEGF被認為是一種最主要的血管新生誘導因子24–6。 因為我們這個研究的目的是說明鯊魚肉油和橄攬油混合物能完全抑制血管新生誘導因子、所以有必要觀察它是如何影響VEGF活性的。 有很多機理可以幫助解釋。 比如說、對VEGF的產生和轉錄發現有關的遺傳因子發揮作用; 它能通過與VEGF的結合、來抑制VEGF與其血管內皮細胞上的受體的結合; 或者它可以通過阻斷血管內皮細胞上的受體、來阻止VEGF與其血管內皮細胞上的受體的結合。 在我們這個研究中、我們知道了VEGF的幾個受體、然後我們使用了它們中的可溶性受體(相對於細胞結合的受體)。 研究結果清楚表明、鯊魚肉油和橄攬油混合物能通過與兩種VEGF受體中的任何一種結合、來抑制VEGF與其受體的結合、進而抑制血管新生。 考慮到鯊魚肉油和橄攬油混合物的多種成份、我們覺得它與VEGF受體的結合也不足為奇、另外多種成份可能發揮協同作用。

有趣的是、如果將VEGF與鯊魚肉油和橄攬油混合物同時加入到受體中、在各受體上發生的情況非常類似。 鯊魚肉油和橄攬油混合物不單單可以與VEGF相結合、它也可以與血管新生抑制部分有關的受體相結合。 然而、用鯊魚肉油和橄攬油混合物與R2受體前置培養(使它與受體相結合(如與我們估計的那樣))會產生一種加強的抵抗作用、這樣做的目的是防止它與誘導因子相互作用。 這更加幫助我們確認鯊魚肉油和橄攬油混合物能與受體強效結合。 另外、與R1相比、它更容易與R2同源異構體親和。

鯊魚肉油和橄攬油混合物的可能的一種抑制方式是、它可以與VEGF受體結合、而不是與VEGF直接結合。 這樣的話、抑制了VEGF與其血管內皮細胞的結合並抑制血管新生。 我們也發現鯊魚肉油和橄攬油混合物可以抑制其他幾種可誘導血管新生的細胞因子(如FGF–2)。 目前我們還不知道後者中的作用機理、這還需要我們的進一步研究來論證。

如上所述、阻斷VEGF與其受體的結合可能只是鯊魚肉油和橄攬油混合物的數個作用機理之一。 也許它的其他作用機理也與此有關。 比如說、抑制遺傳因子轉錄(指定VEGF遺傳密碼)。 鯊魚肉油和橄攬油混合物中的多種成份使我們的設想更有可能成為現實。

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鳴謝

作者感謝Immuno Research Ltd在整個研究過程中的幫助和鼓勵。
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參考文獻

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